(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号
(43)申请公布日
(21)申请号 202511287008.5
(22)申请日 2025.09.10
(71)申请人 天津市农业科学院
地址 300192 天津市南开区白堤路268号
(72)发明人 李凤美 刘连强 罗莹 贺丽霞
张扬 李淑芳 张志军 王文治
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12Q 1/6858(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/645 (2006.01)
(54)发明名称
一种基于猴头菇转录组序列开发的SSR标记
引物组及其应用
(57)摘要
本发明提供了一种基于猴头菇转录组序列
开发的SSR标记引物组及其应用，属于分子标记
技术领域。本发明所述引物组包括SSR‑14引物
对、SSR‑17引物对、SSR‑33引物对、SSR‑56引物
对、SSR‑63引物对、SSR‑67引物对、SSR‑69引物
对、SSR‑72引物对、SSR‑78引物对、SSR‑81引物
对、SSR‑94引物对、SSR‑95引物对、SSR‑97引物对
和SSR‑99引物对。利用本发明引物组进行群体遗
传多样性分析，填补了猴头菇属基于转录组开发
SSR引物的空白，有助于了解猴头菇属不同种群
之间的遗传联系，为保护遗传资源和制定种质保
存策略提供科学依据。
权利要求书2页 说明书10页
序列表（电子公布） 附图6页
CN 121023078 A
2025.11.28
CN 121023078 A1 .一种基于猴头菇转录组序列的SSR分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括
SSR‑14引物对、SSR‑17引物对、SSR‑33引物对、SSR‑56引物对、SSR‑63引物对、SSR‑67引物
对、SSR‑69引物对、SSR‑72引物对、SSR‑78引物对、SSR‑81引物对、SSR‑94引物对、SSR‑95引
物对、SSR‑97引物对和SSR‑99引物对；
所述SSR‑14引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .1所示，反向引物序列如SEQ ID NO .2
所示；
所述SSR‑17引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .3所示，反向引物序列如SEQ ID NO .4
所示；
所述SSR‑33引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .5所示，反向引物序列如SEQ ID NO .6
所示；
所述SSR‑56引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .7所示，反向引物序列如SEQ ID NO .8
所示；
所述SSR‑63引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .9所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .10所示；
所述SSR‑67引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .11所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .12所示；
所述SSR‑69引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .13所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .14所示；
所述SSR‑72引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .15所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .16所示；
所述SSR‑78引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .17所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .18所示；
所述SSR‑81引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .19所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .20所示；
所述SSR‑94引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .21所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .22所示；
所述SSR‑95引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .23所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .24所示；
所述SSR‑97引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .25所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .26所示；
所述SSR‑99引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .27所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .28所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所有的正向引物连接荧光标记；所述荧
光标记为FAM或HEX。
3.权利要求1或2所述的引物组在猴头菇种质资源鉴定中的应用。
4.权利要求1或2所述的引物组在猴头菇遗传育种中的应用。
5.权利要求1或2所述的引物组在猴头菇群体遗传学分析中的应用，其特征在于，所述
群体遗传学分析包括遗传多样性分析和亲缘关系分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述亲缘关系通过UPMGA进化树进行分析。
权 利 要 求 书
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27 .一种分析猴头菇群体遗传学的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(7 .1)提取猴头菇DNA；
(7 .2)利用权利要求2所述的引物组中的引物对分别对步骤(7 .1)获得的DNA进行PCR扩
增，获得荧光PCR扩增产物；
(7 .3)将步骤(7 .2)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管电泳检测与数据处理；
(7 .4)利用步骤(7 .3)中数据处理结果进行猴头菇群体遗传学分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(7 .2)所述PCR扩增体系以15μL计，包
括以下组分：50ng/μLDNA模板1μL、2×PCRMix 7 .5μL、10mmol/L的正向荧光引物0 .3μL、
10mmol/L的反向引物0.3μL、ddH2 O 5.9μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(7 .2)所述PCR扩增的程序如下：98℃
预变性3min；94℃变性20s，55～60℃退火20s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸
5min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(7 .4)所述猴头菇群体遗传学分析的
具体步骤为：
(10.1)根据所述步骤(7 .3)中数据处理结果，计算SSR位点的各项遗传多样性指标；
(10 .2)统计每个位点的等位基因数、Nei’s基因多样性、Shannon’s多样性指数，计算多
态性信息含量。
权 利 要 求 书
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3一种基于猴头菇转录组序列开发的SSR标记引物组及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种基于猴头菇转录组序列开发的SSR
标记引物组及其应用。
背景技术
[0002]
猴头菇(Hericium erinaceus)，又称猴头菌、猴头蘑，属于多孔菌目、猴头菌科、猴
头属，因子实体形状酷似小猴子的头而得名，子实体味道鲜美，富含蛋白质和多糖，是一种
兼具食、药用价值的名贵食用菌。随着生活水平提高，人们对食物的营养有更高的要求，珍
稀食用菌品种被大面积种植，猴头菇作为一种食药同源的食用菌，被广泛栽培。猴头菇菌株
可以通过无性繁殖产生子实体，如何快速、准确地确定菌株来源，对于菌种溯源和保护极为
重要。
[0003]
随着分子生物学的发展，基因组测序技术的普及，以基因组为基础的分子标记技
术得到快速发展。简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记是一种基于PCR反应
的分子标记技术，一般为1～6个核苷酸重复类型，将几十个核苷酸构成一起的串联重复序
列。每个SSR两侧的序列通常是相对保守的单拷贝序列，在基因组的不同位置广泛分布。SSR
标记相较于其他分子标记具有分布广泛、位点特应性强、重复性高等优点，被广泛应用于遗
传图谱构建、分子标记辅助育种、品种鉴定和遗传多样性研究。
[0004]
因此，利用SSR标记对不同来源猴头菇菌株进行分子标记分析，可为研究猴头菇属
遗传多样性及种质资源鉴别、保护和育种奠定基础。
发明内容
[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于猴头菇转录组序列开发的SSR标记引
物组及其应用。本发明在猴头菇转录组序列的基础上，基于获得的大量SSR信息，通过PCR检
测对选取的部分SSR进行验证和多态性分析，从而获得具有通用型的多态性引物，为猴头菇
属遗传多样性及种质资源鉴别、保护和育种奠定基础。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]
本发明提供一种基于猴头菇转录组序列的SSR分子标记的引物组，所述引物组包
括SSR‑14引物对、SSR‑17引物对、SSR‑33引物对、SSR‑56引物对、SSR‑63引物对、SSR‑67引物
对、SSR‑69引物对、SSR‑72引物对、SSR‑78引物对、SSR‑81引物对、SSR‑94引物对、SSR‑95引
物对、SSR‑97引物对和SSR‑99引物对；
[0008]
所述SSR‑14引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .1所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .2所示；
[0009]
所述SSR‑17引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .3所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .4所示；
[0010]
所述SSR‑33引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .5所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .6所示；
说 明 书
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4
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4[0011]
所述SSR‑56引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .7所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .8所示；
[0012]
所述SSR‑63引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .9所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .10所示；
[0013]
所述SSR‑67引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .11所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .12所示；
[0014]
所述SSR‑69引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .13所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .14所示；
[0015]
所述SSR‑72引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .15所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .16所示；
[0016]
所述SSR‑78引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .17所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .18所示；
[0017]
所述SSR‑81引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .19所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .20所示；
[0018]
所述SSR‑94引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .21所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .22所示；
[0019]
所述SSR‑95引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .23所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .24所示；
[0020]
所述SSR‑97引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .25所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .26所示；
[0021]
所述SSR‑99引物对的正向引物序列如SEQ ID NO .27所示，反向引物序列如SEQ ID
NO .28所示。
[0022]
作为优选，所有的正向引物连接荧光标记；所述荧光标记为FAM或HEX。
[0023]
本发明提供了所述的引物组在猴头菇种质资源鉴定中的应用。
[0024]
本发明提供了所述的引物组在猴头菇遗传育种中的应用。
[0025]
本发明还提供了所述的引物组在猴头菇群体遗传学分析中的应用，所述群体遗传
学分析包括遗传多样性分析和亲缘关系分析。
[0026]
作为优选，所述亲缘关系通过UPMGA进化树进行分析。
[0027]
本发明还提供了一种分析猴头菇群体遗传学的方法，包括以下步骤：
[0028]
(7 .1)提取猴头菇DNA；
[0029]
(7 .2)利用所述的引物组中的引物对分别对步骤(7 .1)获得的DNA进行PCR扩增，获
得荧光PCR扩增产物；
[0030]
(7 .3)将步骤(7 .2)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管电泳检测与数据处理；
[0031]
(7 .4)利用步骤(7 .3)中数据处理结果进行猴头菇群体遗传学分析。
[0032]
作为优选，步骤(7 .2)所述PCR扩增体系以15μL计，包括以下组分：50ng/μLDNA模板
1μL、2×PCR Mix 7 .5μL、10mmol/L的正向荧光引物0 .3μL、10mmol/L的反向引物0 .3μL、
ddH2 O 5.9μL。
[0033]
作为优选，步骤(7 .2)所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性3min；94℃变性20s，55
～60℃退火20s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
说 明 书
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5[0034]
作为优选，步骤(7 .4)所述猴头菇群体遗传学分析的具体步骤为：
[0035]
(10 .1)根据所述步骤(7 .3)中数据处理结果，计算SSR位点的各项遗传多样性指
标；
[0036]
(10 .2)统计每个位点的等位基因数、Nei’s基因多样性、Shannon’s多样性指数，计
算多态性信息含量。
[0037]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的SSR标记引物对，引物
的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了猴头菇属基于
转录组开发SSR引物的空白，有助于了解猴头菇属不同种群之间的遗传联系。为猴头菇属遗
传多样性及种质资源鉴别、保护和育种奠定基础。
附图说明
[0038]
图1为实施例1中猴头菇2号品种引物SSR‑69基因型的毛细管电泳图；
[0039]
图2为实施例1中猴头菇5号品种引物SSR‑69基因型的毛细管电泳图；
[0040]
图3为实施例1中猴头菇22号品种引物SSR‑69基因型的毛细管电泳图；
[0041]
图4为实施例1中猴头菇2号品种引物SSR‑72基因型的毛细管电泳图；
[0042]
图5为实施例1中猴头菇5号品种引物SSR‑72基因型的毛细管电泳图；
[0043]
图6为实施例1中猴头菇22号品种引物SSR‑72基因型的毛细管电泳图；
[0044]
图7为实施例1中猴头菇2号品种引物SSR‑78基因型的毛细管电泳图；
[0045]
图8为实施例1中猴头菇5号品种引物SSR‑78基因型的毛细管电泳图；
[0046]
图9为实施例1中猴头菇22号品种引物SSR‑78基因型的毛细管电泳图；
[0047]
图10为实施例1中猴头菇2号品种引物SSR‑95基因型的毛细管电泳图；
[0048]
图11为实施例1中猴头菇5号品种引物SSR‑95基因型的毛细管电泳图；
[0049]
图12为实施例1中猴头菇22号品种引物SSR‑95基因型的毛细管电泳图；
[0050]
图13为实施例1中猴头菇2号品种引物SSR‑97基因型的毛细管电泳图；
[0051]
图14为实施例1中猴头菇5号品种引物SSR‑97基因型的毛细管电泳图；
[0052]
图15为实施例1中猴头菇22号品种引物SSR‑97基因型的毛细管电泳图；
[0053]
图16为实施例2中利用14对引物在31份猴头菇属遗传多样性聚类分析图。
具体实施方式
[0054]
本发明提供一种基于猴头菇转录组序列的SSR分子标记的引物组，所述引物组包
括SSR‑14引物对、SSR‑17引物对、SSR‑33引物对、SSR‑56引物对、SSR‑63引物对、SSR‑67引物
对、SSR‑69引物对、SSR‑72引物对、SSR‑78引物对、SSR‑81引物对、SSR‑94引物对、SSR‑95引
物对、SSR‑97引物对和SSR‑99引物对，具体见表1。
[0055]
表1SSR引物序列
说 明 书
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6[0056]
[0057]
[0058]
在本发明中，所有的正向引物连接荧光标记；所述荧光标记为FAM或HEX，具体见下
说 明 书
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7表1。
[0059]
本发明提供了所述的引物组在猴头菇种质资源鉴定中的应用。
[0060]
本发明提供了所述的引物组在猴头菇遗传育种中的应用。
[0061]
在本发明中，所述遗传育种包括育种和分子标记辅助育种。
[0062]
本发明还提供了所述的引物组在猴头菇群体遗传学分析中的应用，所述群体遗传
学分析包括遗传多样性分析和亲缘关系分析。
[0063]
在本发明中，所述亲缘关系通过UPMGA进化树进行分析，使用的软件为GenAIex。
[0064]
本发明还提供了一种分析猴头菇群体遗传学的方法，包括以下步骤：
[0065]
(7 .1)提取猴头菇DNA；
[0066]
(7 .2)利用所述的引物组中的引物对分别对步骤(7 .1)获得的DNA进行PCR扩增，获
得荧光PCR扩增产物；
[0067]
(7 .3)将步骤(7 .2)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管电泳检测与数据处理；
[0068]
(7 .4)利用步骤(7 .3)中数据处理结果进行猴头菇群体遗传学分析。
[0069]
在本发明中，提取猴头菇DNA。所述DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒提取供
试猴头菇的基因组。
[0070]
在本发明中，所述的引物组中的引物对分别对步骤(7 .1)获得的DNA进行PCR扩增，
获得荧光PCR扩增产物。所述PCR扩增体系以15μL计，包括以下组分：50ng/μLDNA模板1μL、2
×PCRMix 7 .5μL、10mmol/L的正向荧光引物0 .3μL、10mmol/L的反向引物0 .3μL、ddH2 O 5 .9μ
L。步骤(7 .2)所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性3min；94℃变性20s，55～60℃退火20s，
72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
[0071]
在本发明中，将步骤(7 .2)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管电泳检测与数据处
理。所述数据处理使用DataFormater、GeneMaker软件。
[0072]
在本发明中，步骤(7 .4)所述猴头菇群体遗传学分析的具体步骤为：
[0073]
(10 .1)根据所述步骤(7 .3)中数据处理结果，计算SSR位点的各项遗传多样性指
标；
[0074]
(10 .2)统计每个位点的等位基因数、Nei’s基因多样性、Shannon’s多样性指数，计
算多态性信息含量。
[0075]
在本发明中，使用Popgen32软件计算SSR位点的各项遗传多样性指标。
[0076]
在本发明中，使用GenAIex软件，基于Nei的遗传距离，构建UPGMA聚类树。其中多态
性信息含量指数越大说明多态性越高，表明引物为高度多态性引物。
[0077]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解
为对本发明保护范围的限定。
[0078]
实施例1
[0079]
对来自天津市农业科学院新鲜的猴头菇子实体组织，液氮冷冻后‑80℃超低温冰
箱保存。采用Pacbio SMRT Resq测序平台进行了转录组测序。
[0080]
使用MISA软件对猴头菇转录组拼接组装后的unigene序列数据进行SSR位点搜索。
采用默认参数设置：单核苷酸重复10次，二核苷酸重复6次，三～六核苷酸分别重复5次。使
用Primer3软件对含有SSR位点序列进行批量引物设计，每条SSR位点设计3组引物。参数设
定为：退火温度(Tm)57～63℃，引物长度18bp～27bp，上游引物和下游引物的Tm差值≤2℃。
说 明 书
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8[0081]
通过该方式成功设计出120对SSR标记引物，利用3个猴头菇属物种(2号、5号、22
号，表3)的DNA模板对120对引物进行了多态性SSR标记的筛选。筛选标准为：引物多态性的
PIC值大于0 .5，多态性好，特异性强，带型清晰、退火温度相对一致且扩增峰对应的等位基
因能将各个品种区分。初步筛选结果显示，有24对引物能成功扩增出清晰的条带且具有良
好的重复性。初筛得到的24对引物分别对猴头菇属31份的DNA样品进行PCR扩增，使用毛细
管电泳实验来检测产物(见图1～15)，筛选出多态性较好的14对引物，序列见表1。由上海生
物工程股份有限公司合成。
[0082]
表1SSR引物序列
[0083]
说 明 书
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9[0084]
[0085]
由图1～15可知，猴头菇2号、5号、22号三个品种在五个SSR标记引物(SSR‑69、SSR‑
72、SSR‑78、SSR‑95、SSR‑97)中能稳定扩增出不同的电泳峰谱，对应不同的等位基因，这些
标记引物组合能将这三个品种有效区分开来。
[0086]
实施例2
[0087]
基于实施例1合成的SSR引物，应用于猴头菇属遗传多样性聚类分析：
[0088]
(1)提取待测猴头菇基因组DNA；以31份猴头菇样本(表2)验证开发的SSR标记有效
性。按照植物基因组DNA提取试剂盒(购自上海生工生物有限公司)的说明提取供试菌株的
基因组。
[0089]
(2)按照表1中所对应的荧光标记基因，将每对引物的正向引物加上荧光标记，得
到正向荧光引物。
[0090]
(3)以步骤(1)提取的待测样品基因组DNA为模板，以反向引物、正向引物进行PCR
扩增，得到荧光PCR扩增产物；其中PCR扩增体系如下：以15μL计，50ng/μLDNA模板1μL、2×
PCR Mix 7 .5μL、10mmol/L的正向荧光引物0 .3μL、10mmol/L的反向引物0 .3μL、ddH2 O 5 .9μ
L。所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性3min；94℃变性20s，55～60℃退火20s，72℃延伸
40s，共35个循环；最后72℃延伸5min。最后，将反应体系置于4℃保存。
[0091]
(4)取1μL上述PCR产物加9μL上样，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪ABI
3730XL进行电泳检测。
[0092]
(5)对毛细管电泳数据进行分析，采用DataFormater、GeneMaker软件进行处理。使
用Popgen32软件计算SSR位点的各项遗传多样性指标(结果见表3)。
[0093]
表2供试猴头菇菌株信息
说 明 书
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10[0094]
[0095]
表3猴头菇属14对SSR位点多态性分析
[0096]
说 明 书
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11
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11[0097]
[0098]
由表3可以看出，在31份猴头属样品中，检测到了总共79个多态性位点，每对引物
平均含有5 .6个多态性位点。Nei’s基因多样性指数(H)的范围为0 .3179～0 .7883之间。平均
Shannon，s多样性指数(I)为1 .0936，14个SSR位点多态性信息含量(PIC)在0 .2765～0 .7602
之间，均值为0 .5043，SSR‑14位点PIC值最小为0 .2756，SSR‑78位点PIC值最大为0 .7602，14
个SSR位点多态性PIC值差距较大。结果表明，所筛选出的引物具有较高的多态性(PIC>
0 .5)，适用于猴头菇遗传多样性研究。所选取的猴头菇属样品表现出了较为丰富的遗传多
样。
[0099]
为进一步验证该引物组在猴头菇遗传多样性中的应用，对31份猴头菇样本使用
GenAIex软件，基于遗传距离，构建UPGMA聚类树，见图16。
[0100]
遗传距离结果表明，7株人工栽培菌株里，有5株相似度极高，可认为来源同一个品
种，说明市场上销售的猴头菇菌种存在着同株不同名的现象。野生采集品种里也存在亲缘
关系较近的菌株。31个猴头菇之间的遗传距离为0 .23～0 .98，当遗传距离为0 .3时分为6类：
猴头菇9‑19和猴头菇9‑6、猴头菇9‑1、猴头菇9‑18各自为1个类群；猴头菇Hq、华中、东北、蓟
县、百菌香、云南、花果山7个菌株可分为1类；其他20个菌株可分聚为一类。
[0101]
基于PacBio SMRT测序猴头菇全长转录组信息开发了SSR标记，利用有多态性的
SSR标记对31个不同来源的猴头菇属材料进行了多态性分析及遗传多样性分析。筛选出多
态性较高的14对引物，共检测到了79个等位基因位点，平均Shannon’s信息指数(I)为
1 .0936，平均Nei’s基因多样性指数(H)为0 .5538，表明猴头菇属种质遗传多样性较丰富。聚
类分析表明，遗传相似系数在0 .23～0 .98之间，遗传变异幅度相对适中，但聚类分支较为明
显，在遗传距离为0.3处，将31样品分为6个群类，每个样本可以明确区分。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。
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