(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号
(45)授权公告日
(21)申请号 201610081844 .2
(22)申请日 2016 .02 .05
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 105567844 A
(43)申请公布日 2016 .05 .11
(73)专利权人 杭州市农业科学研究院
地址 310024 浙江省杭州市西湖区转塘镇
杭新路东1号
(72)发明人 陆娜 周祖法 宋吉玲
(74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人 胡红娟
(51)Int .Cl .
C12Q 1/6895(2018 .01)
C12Q 1/04(2006 .01)
C12N 15/11(2006 .01)
C12R 1/645(2006 .01)
(56)对比文件
CN 101985657 A ,2011 .03 .16 ,全文 .
WO 2008101343 A1 ,2008 .08 .28 ,全文 .
CN 101402995 A ,2009 .04 .08 ,全文 .
CN 101402994 A ,2009 .04 .08 ,全文 .
刘麒等 .“猴头菌DNA提取条件及SRAP- PCR
体系的优化”.《吉林农业大学学报》.2011 ,第34
卷(第1期),第66-70页 .
Li G等 .“Sequence-related amplified
polymorphism (SRAP), a new marker system
based on a simple PCR reaction: its
application to mapping and gene tagging
in Brassica”.《Theoretical & Applied
Genetics》.2001 ,第103卷(第2-3期),第455-461
页 .
审查员 郭玉洁
(54)发明名称
鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的引物对及方
法
(57)摘要
本发明公开了一种鉴定猴头菇猴杰2号或大
猴头的引物对及方法。所述引物对包括上游引物
和 下 游 引 物 ，上 游 引 物 为 ：5 ′-
ATTAGCTTGACGTACAGACAGTCG-3′，下游引物为：
5′-TGTTGGAGCAAGGGTGATACGA-3′。本发明引物对
为猴头菇猴杰2号和大猴头共有特异性分子标
记，利用包含所述引物对的PCR方法来鉴定猴头
菇猴杰2号或大猴头，具有检测时间短、准确性
高、容易判断、重复性好等优点，且可以进行快速
的早期鉴别。
权利要求书1页 说明书4页
序列表2页 附图1页
CN 105567844 B
2018.12.11
CN 105567844 B1 .引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，
上游引物为：5′-ATTAGCTTGACGTACAGACAGTCG-3′，
下游引物为：5′-TGTTGGAGCAAGGGTGATACGA-3′。
2 .如权利要求1所述引物对在鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头中的应用。
3 .如权利要求1所述引物对在制备鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的试剂盒中的应用。
4 .一种利用如权利要求1所述的引物对鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的方法，其特征在
于，包括以下步骤：
(1)DNA提取，
(2)PCR扩增，
(3)电泳检测，
若电泳检测结果出现620bp大小的DNA条带，则待测猴头菇品种为猴头菇猴杰2号或大
猴头。
5 .如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为：
6 .如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：
94℃预变性7min；94℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸
7min；4℃保温。
7 .猴头菇猴杰2号和大猴头共有特异性DNA片段，命名为SCAR1，其特征在于，序列如SEQ
ID No .1所示。
权 利 要 求 书
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CN 105567844 B
2鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的引物对及方法
技术领域
[0001]
本发明涉及分子鉴定技术领域，特别是涉及一种鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的
引物对及方法。
背景技术
[0002]
猴头菇(Hericium erinaceus)，又叫猴头菌，只因外形酷似猴头而得名。猴蘑，猴
头，猴菇，是中国传统的名贵菜肴，肉嫩、味香、鲜美可口。猴头菇是一种食药用兼备的珍稀
菌类 ,其子实体和发酵菌丝均可入药。随着人民生活水平的提高，猴头菇也进入了普通家
庭，特别是“非典”以后，猴头菇的营养及药用价值更加被认识，猴头菇市场消费急增，广阔
的市场需求使人工栽培迅速发展。
[0003]
随着猴头菇产业的快速发展，对高产、抗逆的猴头菇种质资源需求愈加迫切。但由
于猴头菇品种本身具有无性繁殖的遗传特性，使得在菌种市场上同种异名，异种同名、假
种、劣种现象普遍存在，再加上菌种质量的退化现象，不仅极大地损害了猴头菇生产者和育
种者的利益，也影响了猴头菇产业的持续健康发展。因此，建立起一套科学可靠、快速便捷
的猴头菇品种鉴定体系至关需要。而我国目前对猴头菇品种质量的监督管理，主要依靠在
生产层面制定的各项生产技术标准，而在菌种质量技术层面尚未取得关键性突破，特别是
缺乏猴头菇良种的早期快速鉴别技术体系。
[0004]
就全国范围内来看，目前猴头菇主栽品种为15个，包括猴杰2号、猴头菇99、猴头菇
G2M5 .496、猴头菇G2M5 .497、猴头菇920、猴头菇911、猴头菇99-1、猴头菇H6、猴王、大猴头、
猴头6号、常山猴头菇、猴头BJ-5、福建猴头菇、猴头菇19号。对这些猴头菇品种的鉴别主要
依据猴头菇菌丝、菌落和子实体形态的宏观现察、生长特性、生理生化反应以及不同菌株间
发生的拮抗反应等，但由于这些方法易受环境因素和生理状况的影响，并且随着品种数量
不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。
[0005]
自本世纪以来，一些基于 PCR的分子标记技术如R A P D (Ra nd om Am pl if i ed
Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列
重复区间扩增多态性)和SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩
增多态性)相继用于了猴头菇的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与猴
头菇性状的连锁、猴头菇品种间的分子鉴别研究很少。况且，这些分子标记技术所采用的均
为共有引物，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种
鉴别，只有开发出某个品种稳定、特异的DNA指纹标记才能真正用于该猴头菇品种的准确快
速鉴定。
[0006]
CN101985657A公开了一种利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种猴王的方法，包括菌
丝培养与收集，基因组DNA的提取，SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测。
使用此发明公开的分子特异性引物猴王F2/R2检测引物进行PCR扩增，猴头菇菌种猴王的特
征扩增产物为371bp。CN101402994A公开了一种利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种猴杰的
方法，具体步骤与CN101985657A中类似，使用此发明公开的分子特异性引物进行PCR扩增，
说 明 书
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CN 105567844 B
3猴头菇菌种猴杰的特征扩增产物为414bp。
发明内容
[0007]
本发明提供了一种鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的引物对，该引物特异性高，利用
该引物进行PCR鉴定，操作简便，准确性高。
[0008]
引物对，包括上游引物和下游引物：
[0009]
上游引物为：5′-ATTAGCTTGACGTACAGACAGTCG-3′，
[0010]
下游引物为：5′-TGTTGGAGCAAGGGTGATACGA-3′。
[0011]
利用序列相关扩增多态性(Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP)
分子标记技术对猴头菇主栽品种的分子鉴别进行探索性研究。提取各猴头菇品种的菌丝基
因组DNA作为模板，用大量SRAP随机引物对进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，
最后筛选得到具有差异条带(仅猴头菇猴杰2号和大猴头有而其余品种没有)的引物一对。
将该差异条带进行切胶回收，然后连接到克隆载体上送去测序，所得DNA片段大小为620bp，
其碱基序列如SEQ ID No .1所示，该DNA片段为猴杰2号和大猴头共有特异性DNA片段。由该
特异性DNA片段设计得到所述引物对。
[0012]
以猴头菇基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，仅猴杰2号和大猴头可稳
定获得620bp大小的特异性DNA片段，而其他猴头菇品种均不能获得该特异性DNA片段。
[0013]
本发明又提供了所述引物对在鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头中的应用。
[0014]
本发明还提供了所述引物对在制备鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的试剂盒中的应
用。所述试剂盒包括所述引物对、DNA提取试剂，PCR所用的聚合酶、缓冲液、dNTP等相关试
剂。
[0015]
本发明还提供了所述引物鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头的方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)DNA提取，
[0017]
(2)PCR扩增，
[0018]
(3)电泳检测，
[0019]
若电泳检测结果出现620bp大小的DNA条带，则待测猴头菇品种为猴头菇猴杰2号
或大猴头，反之则否。
[0020]
本发明方法关键在于扩增引物的选择，至于DNA提取、PCR反应体系和反应条件，以
及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
[0021]
优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：
[0022]
[0023]
其中2×Power Taq PCR Master Mix购自北京百泰克生物技术有限公司。
[0024]
所述的PCR扩增条件为：94℃预变性7min；94℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸
2min，共30个循环；72℃延伸7min；4℃保温。
说 明 书
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CN 105567844 B
4[0025]
利用所述引物对扩增猴头菇猴杰2号或大猴头获得的620bp的DNA片段可以作为猴
头菇猴杰2号和大猴头共有特异性DNA片段，碱基序列如SEQ ID No .1所示。
[0026]
本发明还提供了所述特异性DNA片段作为分子标记在鉴定猴头菇猴杰2号或大猴
头中的应用。
[0027]
当然，在所述特异性DNA片段的基础上，对所述引物对进行个别碱基的增加或减
少，经PCR扩增试验也是只有猴杰2号能稳定获得特异性片段的，也可以用于鉴定猴杰2号或
大猴头。
[0028]
本发明引物对为猴头菇猴杰2号和大猴头共有特异性分子标记，利用包含所述引
物对的PCR方法来鉴定猴头菇猴杰2号或大猴头，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重
复性好等优点，且可以进行快速的早期鉴别。
附图说明
[0029]
图1为利用本发明的分子标记引物对猴头菇猴杰2号、大猴头与其他猴头菇品种进
行PCR扩增结果电泳图，其中1为猴头菇猴杰2号，10为大猴头，2～9、11～15为其它的猴头菇
品种，M为DL2000DNA Marker。
具体实施方式
[0030]
实施例1
[0031]
利用SRAP分子标记技术对15种猴头菇主栽品种的分子鉴别进行探索性研究。提取
各猴头菇品种的菌丝基因组DNA作为模板，用大量SRAP随机引物对进行PCR扩增，扩增产物
用琼脂糖凝胶电泳检测，最后筛选得到具有差异条带(仅猴头菇猴杰2号和大猴头有而其余
品种没有)的引物一对。将该差异条带进行切胶回收，然后连接到克隆载体上送去测序，所
得DNA片段大小为620bp，其碱基序列如SEQ ID No .1所示，该DNA片段为猴杰2号和大猴头共
有特异性DNA片段。
[0032]
针对所得猴杰2号和大猴头共有特异性DNA片段设计引物对，引物对的序列为：
[0033]
上游引物：5′-ATTAGCTTGACGTACAGACAGTCG-3′
[0034]
下游引物：5′-TGTTGGAGCAAGGGTGATACGA-3′，
[0035]
引物由上海生物工程技术有限公司合成。
[0036]
以15种主栽品种猴头菇的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，仅猴
杰2号和大猴头可稳定获得620bp大小的特异性DNA片段，而其他猴头菇品种均不能获得该
特异性DNA片段。
[0037]
实施例2
[0038]
(1)猴头菇良种基因组DNA的提取
[0039]
取待测猴头菇菌丝体0 .03g，加液氮彻底磨碎，利用新型快速植物基因组DNA提取
试剂盒(DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司)提取基因组DNA，获得猴头菇良种
的基因组 D N A粗提物。使用琼脂糖凝胶电泳和D N A / R N A紫外分光光度计 (Na n od r o p
Technologies，USA)检测所得基因组DNA粗提物的完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1 .8的
DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
[0040]
(2)PCR扩增
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5[0041]
PCR反应液组成：2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，10μM上下游特异引物对各
1 .5μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O 4μL。
[0042]
扩增反应在Life ECO型扩增仪(Bioer，杭州博日科技有限公司)上进行。扩增条
件：94℃预变性7min；94℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸
7min；4℃保温。
[0043]
(3)琼脂糖凝胶电泳跑胶检测
[0044]
取步骤(2)PCR扩增产物5μL，与1μL 0 .25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1 .5％的琼
脂糖凝胶上样孔，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下跑电泳。电泳结束后，在含0 .5μg/mL EB
的水溶液中染色30分钟，然后使用美国伯乐自动凝胶图像分析仪(Chemi Doc XRS imaging
system，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行观察和照相。
[0045]
按照上述方法，分别对表一中所示15个猴头菇良种进行检测鉴定，结果见图1。
[0046]
表1猴头菇良种编号及名称。
[0047]
[0048]
[0049]
如图1所示，编号为1的猴杰2号和编号为10的大猴头中扩增出了一条清晰明亮、分
子量大小为620bp的特异DNA条带，而其余编号的猴头菇良种，未见有大小620bp的特殊DNA
条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记用于猴杰2号
或大猴头的鉴别，其稳定性、特异性非常高。
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8图1
说 明 书 附 图
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